叶祖新曾先后就读于杭州演艺学院舞蹈系、中北英皇演艺专修学校。
2003年,还在杭州艺校上学的叶祖新被选中出演《情断上海滩》而进入演艺圈。
2005年,参演古装电视剧《李小环与苗翠花》,饰演方世玉;同年,参演古装宫斗电视剧《大清后宫》,饰演少年道光帝。
2006年参演家庭伦理电视剧《死去活来》,饰演樊涛;参演古装历史电视剧《皇上二大爷》,饰演赵金山。
2008年,参演战争历史电视剧《父亲的战争》,饰演彭龙。
2009年,参演古装历史电视剧《杨贵妃秘史》,饰演韦坚;同年参演家族斗争电视剧《大管家》,饰演李复修;参演战争历史电视剧《内线》,饰演苏子童。
2010年,参演古装历史电视剧《大唐女巡按》,饰演欧阳;参演古装神话电视剧《活佛济公2》,分饰必清、瘦仙童两角;参演寻亲电视剧《杜鹃的女儿》,饰演小吴。
2011年,参演穿越电视剧《步步惊心》,饰演十爷;参演古装搞笑电视剧《怪侠欧阳德》,饰演淳贝勒。
2012年,参演爱情励志电视剧《错点鸳鸯》,饰演冷刚;参演传奇抗战题材电视剧《五台山抗日传奇之女尼排》,饰演任松良;参演古装历史电视剧《薛平贵与王宝钏》,饰演叶公公;参演战争历史电视剧《向着胜利前进》,饰演何医生;参演古装武侠电视剧《新白发魔女传》,饰演辛龙子;在古装历史传奇电视剧《隋唐英雄》中饰演裴元庆。
2014年,参演古装神话电视剧《欢天喜地俏冤家》,饰演高富帅;参演都市爱情电视剧《步步惊情》,饰演JACK;参演古装搞笑爱情电视剧《犀利仁师》,饰演范大同;参演都市爱情电视剧《说好的幸福》,饰演许诺;参演古装历史传奇电视剧《隋唐英雄3》,饰演薛丁山;9月7日,参演的古装剧《美人制造》播出,饰演袁客师。
2015年,1月参演《蜀山战纪之剑侠传奇》,饰演医术不凡的张馅饼;8月参演的抗日电视剧《铁在烧》在浙江、安徽卫视播出,饰演走上歧路悲剧收场的丁丑娃。9月,主演的爱情喜剧电影《穷途》上映,饰演前往苗寨寻找药方的男主角邹孝宇;参演都市情感电视剧《爱情万万岁》,饰演为爱痴狂的90后新新人类金波。11月,参演庄园爱情电视剧《我们的秘密》,饰演为情所苦的造型师罗仁;与黄世超、杨世瀚、张思帆共同演唱的电视剧《蜀山战纪》片尾曲《我就是我》单曲发布。12月,主演民国动作悬疑电视剧《左眼诡事》,饰演左眼能看到鬼魂的男主角尹明涯。
2016年3月10号,由著名导演梁凯程指导,台湾金牌编剧边立民实力操刀,叶祖新、沈梦辰、倪景阳等实力偶像联袂主演的2016年度都市青春偶像时尚大戏《起床吧!太阳》举行了开机仪式;8月,参演都市剧《一粒红尘》,饰演痴情的酒吧老板闵朗。12月,主演的青春励志偶像剧《食全食美》开机,饰演男主角打假卫士吴佑。
2017年3月31日,参演的悬疑电影《嫌疑人X的献身》在中国大陆上映,饰演破案的线索人物罗淼警官。
2018年1月13日,参加《快乐大本营》。9月17日,主演的现实题材电视剧《橙红年代》播出。
2019年9月9日,参演的电视剧《我在未来等你》在爱奇艺播出,在剧中饰演成年郑伟。
2020年1月5日,参演的电视剧《还没爱够》在浙江卫视、江苏卫视播出,在剧中饰演汪聪。4月7日,参演的电视剧《清平乐》在湖南卫视、腾讯视频播出,在剧中饰演张茂则。12月12日,参加的综艺节目《我就是演员3》定档在浙江卫视播出。
2021年7月1日,参演的电影《1921》定档在中国内地上映,在片中饰演顾祝先。同日,发行合唱单曲《没有共产党就没有新中国》。10月29日,主演的电影《青春作伴好还乡》定档在中国内地上映,在片中饰演管松江。
2022年1月14日,参加的综艺节目《青春环游记3》定档在浙江卫视播出。7月5日,参演的电视剧《星汉灿烂》定档在中国内地播出。12月22日,主演的电视剧《青春正好》定档在优酷播出,在剧中饰演彭书望。
2023年,参演电视剧《九义人》,在剧中饰演徐之暘。同年,参演电视剧《镇魂街之热血再燃》,在剧中饰演应乘风;4月23日,领衔主演的电视剧《战火中的青春》定档在江苏卫视、优酷、爱奇艺首播,在剧中饰演叶润名。
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