吴昱翰小学就读于钢都小学,之后进入鞍山市艺术学校就读,并于2002年考入解放军艺术学院戏剧系。2013年加入开心麻花团队,参与话剧、影视创作和表演。
2005年,参演张峻宁、郑柔美、牛萌萌主演的都市情感剧《五星大饭店》,在剧中饰演舞蹈组合“真实”成员王奋斗,这是他的首部电视剧作品,从而正式开始演员生涯;同年,参演朱翊执导的军旅剧《我是一个兵》;此外,他还凭借小品《安全感》获得了第5届中央电视台全国小品大赛二等奖、优秀表演奖、优秀编剧奖。
2006年4月14日,由哈斯朝鲁执导的剧情电影《飘逝的红裙子》上映,吴昱翰在片中饰演陈燕的弟弟陈浩,与吕晶饰演一对姐弟。
2007年,与刘晓洁、范雷、杨成联袂主演魔幻情景喜剧《糊涂小天使》,在剧中饰演别墅租客、啃老族于东东;同年,参演刘佩琦、王雅捷、李幼斌主演的现代军旅剧《我是太阳》;此外,他还担任了话剧《大话紫竹园》的导演及联合编剧。
2008年12月2日,与陈思成、郑昊、徐佳合作主演的青春励志电影《霓虹灯下新哨兵》上映,在片中饰演被父母送到部队锻炼的富家子弟皮向峰;同年,参演夏祖辉执导的歌舞电影《少年荀子之青春的心》;此外,他还担任了话剧《爱情来了你就上》、《逃花运》的导演及编剧。
2010年,与万思维、蒲巴甲、郑罗茜联合主演军旅剧《第五空间》,在剧中饰演陆航学院实验班学生、翼虎团飞行员关怀;11月,执导以街舞为题材的青春励志话剧《舞678》。
2011年,参演张明健、李曼、张铁林、寇振海主演的近代革命剧《博弈》,在剧中饰演军统特务姜世伟的亲信何宇。
2012年10月26日,参演的电视剧《博弈》播出,在剧中饰演何宇。
2013年12月,执导舞台剧《爷们儿·叁》。
2015年2月21日,执导的电视剧《江湖学院》第一季播出。
2016年6月25日,在胶东剧院上演舞台剧《李茶的姑妈》;10月20日,自编自导的电视剧《众里西餐厅》播出。
2018年9月30日,执导的电影《李茶的姑妈》上映。
2019年1月18日,凭借《李茶的姑妈》获第10届金扫帚奖最令人失望导演处女作提名;11月,执导并参演电影《我爸是传奇》;12月20日,主演的电影《半个喜剧》在中国大陆上映,在剧中饰演孙同;同日,发行合唱单曲《疯船长》;同月,发行单曲《如果我不是我》。
2020年11月7日,凭借《半个喜剧》获第33届中国电影金鸡奖最佳男主角提名。
2021年5月1日,主演的电影《摸金玦之守护人》定档在腾讯视频上映,在片中饰演胡八一;同年,主演电影《我经过风暴》;9月30日,参演的电影《我和我的父辈》定档在中国内地上映,在片中饰演成年小小。
2022年1月9日,参加的综艺节目《麻花特开心》定档在优酷播出;1月11日,参加的综艺节目《麻花局中局》在优酷播出;同年,与李牧展共同执导的电影《我是你爸!》上映,并在剧中饰演万小鹏。
2023年5月20日,主演的电影《请别相信她》定档在中国内地上映,在片中饰演方耀东。5月26日,主演的电影《我经过风暴》定档在中国内地上映,在片中饰演陈均。
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